重磅发布|中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识

引言

宏基因组测序技术（mNGS）因其覆盖度广、特异性好等特点越来越多地被应用于临床感染性疾病的精准诊断，但因一直没有相应的标准而无法在临床进行更为规范化的开展。2020年11月15日，复旦大学附属华山医院张文宏教授作为通讯作者、艾静文博士作为执笔秘书在《中华传染病杂志》发表了“中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识”。作为全球首篇针对所有感染性疾病的宏基因组学临床应用专家共识，该共识就第二代测序技术的临床应用范围、样本采集、分析解读和诊断效能等进行了证据总结，给出27条推荐意见，首次针对不同感染症候群、不同病原体的适应范围给出了相应的推荐意见，并在共识中多次强调质量控制与数据量的重要性。

目

录

二代测序的临床需求与应用范围：推荐意见1-10

二代测序的流程与质量控制：推荐意见11-17

二代测序结果的临床应用建议及其临床判读、验证：推荐意见18-20

二代测序在临床感染性疾病中针对不同病原体类型的诊断效能：推荐意见21-26

二代测序在成本经济效益分析下的临床应用推荐：推荐意见27

二代测序的临床需求

推荐意见1

若怀疑细菌、真菌、DNA病毒、寄生虫、不典型病原体感染且需进行二代测序检测时，建议采用DNA检测；若怀疑RNA病毒感染时，则建议采用RNA法检测（A,Ⅱ）。

推荐意见2

对于临床疑似感染的病重、病危或免疫抑制、免疫缺陷的感染患者，建议在完善传统实验室及分子生物学检测的同时，采集疑似感染部位的标本进行二代测序（B,Ⅱ）。

二代测序在感染性疾病诊断领域中的优势在于其能检测到其他传统手段无法检测到的病原体。另外，二代测序也被报道可用于“排除”检测，即检测阴性有助于排除感染性疾病的诊断，但前提条件是足够高的测序数据量来达到足够的灵敏度。二代测序的其他潜在应用还包括病原体的耐药基因检测、医院感染控制的监测，以及社区传染性疾病暴发的监测，但这些应用通常需要极高的覆盖深度。

二代测序在临床疑似中枢神经系统感染中的适用范围

推荐意见3

对于怀疑中枢神经系统急性感染的患者，如有条件，推荐在抽取脑脊液时同步留取2mL脑脊液标本保存于-16~20℃冰箱。在完成常规生物化学检查和培养之后，若3d内未获得明确的病原学依据且经验性抗感染治疗无效，推荐对留存脑脊液标本进行二代测序检测。若未留存标本，可重新采集标本（A,Ⅱ）。

推荐意见4

对于疑似中枢神经系统病毒感染的患者，如有条件，推荐在抽取脑脊液时同步留取2mL 脑脊液标本保存于-16~20℃冰箱。在传统PCR分子检测（包括多重探针分子PCR方法）后若未能获得明确的病原学依据，推荐对留存脑脊液标本进行二代测序检测。若未留存标本，可重新采集标本（A,Ⅱ）。

推荐意见5

对于慢性中枢神经感染及需要随访病原学证据的患者，可首选二代测序进行检测 （A,Ⅱ）。

二代测序在临床疑似血流感染中的适用范围

推荐意见6

对于怀疑血流感染的患者，如有条件，推荐在抽取血培养标本时同步留取2mL血标本，分离血浆后保存于-16~20℃冰箱，血培养3d未报阳且经验性抗感染治疗无效时，推荐对留存血标本进行二代测序检测。若未留存标本，可重新采集标本（A,Ⅱ）。 

推荐意见7

对于怀疑继发性血流感染的患者，在原发感染灶的病原学检测阴性或因各种因素无法送检合适标本进行检测的情况下，可考虑将血标本的二代测序检测作为二线检测方法（B,Ⅲ）。

由于大部分血流感染的病原体包括细菌、真菌、寄生虫（如疟原虫）、部分病毒（如疱疹病毒）均以DNA作为遗传物质，所以推荐将DNA二代测序作为血流感染的首选检测方法，仅在不能排除RNA病毒感染（如肾综合征出血热、登革热、病毒性肺炎等）时推荐进行RNA二代测序。

二代测序在临床疑似局灶感染中的适用范围

推荐意见8

对于怀疑局灶感染的患者，在对局灶部位完成常规的生物化学、培养或PCR检测后，若未能获取病原学诊断结果，推荐将二代测序作为二线的首选检测手段（B,Ⅱ）。

二代测序可提高皮肤软组织感染、骨关节感染、眼内感染、尿路感染、浆膜腔感染、其他组织感染中的病原学检测能力。

二代测序在临床疑似呼吸道感染中的适用范围

推荐意见9

对于呼吸道感染患者，若3d内未通过传统实验室检查获得明确的病原学依据且经验性抗感染治疗无效，推荐留取呼吸道标本进行二代测序检测（A,Ⅱ）。

推荐意见10

对于强烈怀疑病毒性肺炎且病情持续进展的患者，可先完善呼吸道病毒多重PCR检测，若为阴性，再行二代测序检测，并应同时进行核酸RNA反转录（A,Ⅱ）。

对临床疑似呼吸道感染的患者进行mNGS检测，可对包括呼吸道定植菌群和引起感染的病原菌同时进行检测，并可对多重感染进行鉴定。

目前，商业化的mNGS检测产品数据量大多在20M左右，灵敏度低于荧光PCR等传统分子检测方法，尚不能替代传统检测方法（除非提高数据量使其灵敏度大于传统分子检测方法），而是应作为传统方法无法明确感染病原体时的补充。

样本采集

推荐意见11

采集样本送检二代测序必须严格遵守无菌原则（A,Ⅱ）。

推荐意见12

样本应直接从患者感染部位的体液或组织中进行采集（A,Ⅱ）。

推荐意见13

当患者存在感染表现但病情危重或不能耐受有创操作时，可考虑采集患者的血液标本送检（B,Ⅱ）。

检测流程及质量控制

推荐意见14

实验室在充分保障生物安全性的前提下，应建立完整的核酸检测流程（样本采集，样本前处理/核酸抽提及文库建立，质量控制及生物信息分析，二代测序结果的实验室判读）（A, Ⅲ）。

质量控制体系应包含多个质量控制点，依次为样本运输温控、提取浓度与纯度、出库浓度、文库片段分布、下机总数据量、测序质量（Q20、Q30比率）等，分别监控运输温度、核酸提取、文库构建、下机数据可靠性等方面。

推荐意见15

每批次实验中都应包括内参照、阴性对照品和阳性对照品。每批次实验均需严格评估是否存在操作或环境带来的污染。单个样本测序数据量特异性序列片段数建议不低于2×10^7条（即20M特异性序列），此外建议测序序列读长不少于单端50bp（A,Ⅲ）。

推荐意见16

对数据进行分析时，建议采用临床应用级别的数据库，审慎使用公共数据库（A,Ⅲ）。

推荐意见17

建议二代测序检测病原体的报告应涵盖该批次实验中的内参照、阴性对照品和阳性对照品结果，并记录相关质量控制标准，如单个样本数据量、序列读长，以及相关的质控参数（A,Ⅲ）。

另外，在报告解读流程中，除试剂、环境、测序和生信分析流程中引入的假阳性病原体信息，应将样本中含有的病原体核酸信息真实地呈现给临床。

二代测序结果的临床应用建议及其临床判读、验证

推荐意见18

二代测序结果应在与患者临床表现及实验室检查密切结合的前提下进行解读和验证（B,Ⅲ）。

若二代测序结果符合患者的临床表现和其他实验室检查，推荐根据二代测序结果指导临床决策。

若患者二代测序结果阳性且符合临床表现，但缺乏除二代测序结果外的其他实验室支持证据，应进行PCR验证（在具有合适引物的条件下），并建议临床进一步完善可获得的传统实验室检查加以验证。

若患者二代测序结果阳性，但临床表现或实验室检查结果不支持该结果，则不能仅根据二代测序结果进行诊断，而应以传统实验室检查结果为首要临床参考依据。

推荐意见19

对于疑似中枢神经系统、血流、呼吸道感染或需排除感染性疾病的患者，根据推荐意见1至13采集合适的样本进行二代测序，根据送检样本类型结合患者的临床表现及其他结果辅助判断或排除诊断，同时应注意排除检出病原体定植的情况（B,Ⅱ）。

推荐意见20

对于二代测序结果为阴性，但根据其他辅助检查结果（如培养结果）高度提示感染可能的尚不能排除感染的患者，建议必要时再次取样重复二代测序检测（B,Ⅱ）。

二代测序在临床感染性疾病中针对不同病原体类型的诊断效能

推荐意见21

在中枢神经系统感染中，目前证据提示二代测序检测细菌、寄生虫、病毒的效果较好，中枢神经系统真菌感染仍需更大样本量的临床 试验来检验其检测效能（B,Ⅱ）。

推荐意见22

对于脓毒症患者，推荐联合采用传统实验室培养和二代测序来提高病原学的检出率（B,Ⅱ）。

推荐意见23

对于局灶脓肿或组织感染患者，二代测序的总体灵敏性和特异性均较好，其中对细菌检测的灵敏性优于真菌（A,Ⅱ）。

推荐意见24

对于呼吸道感染，二代测序在病毒及少见病原体的检测中体现出较好的检测效能；但在细菌、真菌等病原体的检测中，二代测序尚不能准确判断菌群定植或感染状态，仍需依赖临床医师结合患者病情进行进一步分析（A,Ⅱ）。

二代测序应用于呼吸道感染病原体（病毒较多）的检测效能显示，当样本中病原微生物含量较高时，二代测序的总体检测效能与PCR差距不大；但当病毒载量较低时，当前二代测序（20M左右数据量）会出现假阴性，在灵敏度方面不如PCR，需要通过进一步增加数据量来提高检测灵敏度。

推荐意见25

对于结核分枝杆菌、伤寒沙门菌、布鲁菌等胞内菌，以及具有细胞壁的真菌，二代测序的检测效能会相对降低，应对上述菌群设定特定的序列数阈值（A,Ⅲ）。

推荐意见26

对于新发、罕见、疑难感染性疾病，以及免疫缺陷患者，二代测序能显著提高病原体的检出率，可作为上述疾病的一线检测手段（Ａ，Ⅲ）。

二代测序在成本经济效益分析下的临床应用推荐

推荐意见27

目前，二代测序开展成本仍较高，尚不能作为轻症感染性疾病的一线检测手段（A,Ⅲ）。

后

记

作为全球首篇针对所有感染性疾病的宏基因组学临床应用专家共识，该共识遵循循证医学原则，共引用54篇文献，中国19篇，占比35%（华大基因参与了其中众多成果的合作），彰显了宏基因组学技术在感染性疾病精准诊疗应用中的中国力量。本次新冠疫情初期，正是得益于我国宏基因组测序技术在临床不明感染中的日益广泛应用，在利用宏基因组学进行不明原因肺炎查因中新冠病毒得以被快速的发现及确定，并在疫情的早期为国家制定应急防控方案提供了病原依据。

该共识中多次强调数据量对mNGS检测的重要性，并指出单个样本测序数据量特异性序列片段数建议不低于2×10^7条（即20M特异性序列）。

mNGS的理论灵敏度指检测到病原微生物1条序列即判定为阳性检出时，所需单位体积内的微生物个数病原微生物个数=(样本单位体积人细胞含量×人基因组碱基数)/(检出总序列数×微生物基因组碱基数)。

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综上，当mNGS的数据量（即检出总序列数）越高时，检测的灵敏度也越高。当前平均20M reads基本是最低数据量，临床检测效能也仅有50%左右，主要是基于社会经济性的考虑。为了切实保障临床检测效果，共识中推荐意见17也提出数据量要作为质量控制标准，涵盖在二代测序的报告内容中。

近年来随着测序技术的进步和以华大基因自主研发生产的测序仪为代表的国产化测序平台的使用，已使得测序成本不断降低，给宏基因组技术的临床应用带来了切切实实的经济可及性，极大促进了技术在国内的快速临床转化和应用。另外，可能很快会推动实现在相同的成本下具有更高的数据量覆盖（比如100M reads），这将进一步提高临床疑难未知感染病原的确诊率。已有数据模拟和临床测试标本显示当数据量为100M reads时临床检测效能将提高到80%以上。

mNGS工作流涉及多个过程，包括样本采集、样本前处理、核酸抽提、文库建立、测序、生物信息分析、实验室判读等。每个流程都应有相应的质量控制体系来对本次检测进行监控，才能有效保证报告结果的可信度和准确性。共识中也对该部分提出了多达7条推荐意见（见推荐意见11-17），并强调内参照、阳性对照品、阴性对照品应包含在每批次mNGS检测中。

在共识的最后，还提出随着技术的进一步成熟，未来二代测序病原体检测应进一步在成本下降、诊断标准完善、质量控制提升等方面进行完善。同时应进一步增加大样本量的研究，以建立中国感染病原体宏基因组学检测的标准规范。

备注：

证据强度：A为强烈推荐；B为推荐，但其他替代方案也可接受；C为推荐强度低，寻求替代方案；D为从不推荐。

证据质量：Ⅰ为证据来自随机对照试验，Ⅱ为证据来自非随机对照试验，Ⅲ为证据仅来自专家意见。

mNGS在临床感染性疾病精准诊断的应用任重而道远，但已经迈出了至关重要的一步。

作者：赵晓晶

校审：孙经梦

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